Потеря клеточности и проблема Дильмана: исследование in silico

Введение

В.М. Дильманом была впервые поставлена проблема противоречия между гомеостазом и развитием, частым случаем которой является необходимость существования систем обратной связи, поддерживающих постоянные уровни гормонов с одной стороны и постоянных трендов увеличения содержания гормонов (последнее необходимо для реализации программы развития). Источник:

Чистяков В.А., Денисенко Ю.В. (2012) Потеря клеточности и проблема Дильмана: исследование in silico, Биохимия 77, 936 - 951. Дильман считал, что такие тренды создаются за счет прогрессирующего снижения чувствительности рецепторов, а тренды чувствительности рецепторов задаются изменениями активности генов. В конце концов, чувствительность снижается настолько, что это приводит к патологическим последствиям (нормальным болезням старения). Согласно Разработанной Дильманом элевационной теории ключевым моментом старения является потеря чувствительности гипоталамуса к гормональным сигналам, которая ведет к остановке регулируемой гипофизарно-гипоталамической системой гормональных циклов.

Мы предположили, что длительные тренды роста концентраций гормонов могут быть следствием ухудшения работы желез, вырабатывающих ингибиторы синтеза, которое развивается в результате потери клеточности желез. Задачей данной работы было создание, с использованием разработанного ранее аппарата мультиагентного моделирования, модели, позволяющей имитировать возрастные изменения гормональных циклов на основе данного предположения.

Проведенные с ее помощью эксперименты in silico убеждают, что феномен потери чувствительности к гормональным сигналам с последующей остановкой циклов может быть имитирован в простейшей модельной системе, а в основе данного явления, как и в основе большинства геронтологических феноменов, может лежать потеря клеточности. Главный практический смысл нашей работы состоит в иллюстрации того, что вещества замедляющие потерю клеточности, теоретически, могут быть эффективными супрессорами характерных для старения гормональных изменений.

Ключевые слова: старение, имитационное моделирование, потеря клеточности, гормоны, элевационная теория, апоптоз.




Анализ современной геронтологии позволяет сделать вывод о том, что она находится в состоянии перехода от накопления фактов к созданию общей теории. Множественность теорий старения, «мирное сосуществование» которых стало в определенной мере визитной карточкой биологии старения, послужила средством систематизации экспериментальных фактов. Тем не менее, как мы упоминали в наших работах [1,2] общая или рациональная теория старения не может быть создана без определенной селекции, основанной на выделении существенных для работы механизма старения процессов.

Одним из инструментов, помогающих такой селекции, может быть математическое мультиагентное моделирование, которое позволяет формировать in silico множество самостоятельных объектов, взаимодействующих друг с другом и средой по заданным исследователем правилам. Как мы уже писали [2], смысл применения математических методов в том, чтобы добиться воспроизведения in silico «внешних» проявлений старения, при помощи наиболее простого «внутреннего механизма». Такой механизм, по-видимому, и будет наиболее существенным двигателем старения. Естественно, моделирование «внутреннего механизма» должно опираться на биологические факты, как минимум не противоречить им.

Наша работа [1] была посвящена созданию модели, позволяющей имитировать связанное с возрастом падение клеточности однородной популяции клеток. Биологическая составляющая использованного подхода основана трех положениях:
1. Старение многоклеточного организма связано не столько с ухудшением качества клеток, сколько с уменьшением их количества. Эта идея сформулирована впервые выдающимся физиком Лео Сциллардом [3]. Расчеты Сцилларда показали, что гибель клеток за счет случайных внутренних событий может обеспечить возрастное снижение жизнеспособности организма с динамикой, совпадающей с наблюдаемой в реальных условиях. Для события, приводящего к гибели клетки, Сциллардом было введено понятие «Aging hit».
2. «Aging hit» развивается в результате запуска программ клеточной смерти, в частности апоптоза.
3. Программа клеточной смерти запускается в результате случайных флуктуаций уровня соответствующих стимулов, способных запустить механизм программируемой клеточной смерти.

Созданная нами модель позволяет видеть, как снижается численность клеток, в которых идет генерация апоптозных сигналов, различия по интенсивности которых подчиняются нормальному закону. Гибель части клеток инициируется после превышения одинакового для всех клеток уровня апоптозного сигнала. Даже такая примитивная модель позволила предложить объяснения для ряда экспериментальных фактов, связанных с исследованием антиоксиданта нового поколения SkQ1.

В работе [2] (представленной на этом сайте) нами была описана модель старения Drosophila melanogaster – одного из популярных объектов экспериментальной геронтологии. Модель основана на тех же принципах, что и описанная в предыдущей работе. Выживание генерируемых программой особей зависело от доли сохранившихся мотонейронов. Эксперименты in silico, поставленные с ее использованием позволяют генерировать кривые дожития, аналогичные получаемым в экспериментах с реальными насекомыми. Таким образом, на основании синтеза представлений о потере клеточности как основе старения, о программируемой клеточной смерти и свободнорадикальной теории старения удалось создать простейший механизм, имитирующий важные элементы феноменологии старения. Моделирование старения дрозофилы облегчается тем, что это постмитотический короткоживущий организм.

Сроки жизни даже наиболее короткоживущих млекопитающих значительно дольше. В старении таких более сложных форм ключевую роль начинают играть изменения физиологических циклических процессов. В основе большинства физиологических циклов лежат циклические изменения в выработке гормонов. Старение сопровождается сбоями таких фундаментальных циклов как цикл сна и бодрствования, эстральный и менструальный циклы и т.д. Именно начало и прекращение гормональных циклов определяет начало и прекращение этапов постнатального онтогенеза.

Начало научному анализу роли циклических процессов в работе программы старения было заложено В.М. Дильманом. Он впервые обозначил проблему противоречия между гомеостазом и развитием, ключевую для биологии развития вообще и геронтологии в частности. Именно постановка этой проблемы является по нашему мнению основным вкладом Владимира Михайловича в теорию старения. Схематически описать основную идею Дильмана можно следующим образом:
1. Постоянство параметров биосистем, в том числе и концентраций гормонов поддерживается механизмами отрицательной обратной связи
. 2. Но для развития должны существовать длительные тренды концентраций гормонов, в частности половых и т.д.
3. Дильман считал, что такие тренды создаются (и, соответственно, проблема решается) за счет трендов снижения чувствительности рецепторов, а тренды чувствительности рецепторов задаются изменениями активности генов.
4. В конце концов, чувствительность снижается настолько, что это приводит к патологическим последствиям (нормальным болезням старения).

Наиболее четко «кибернетическая составляющая» взглядов Дильмана была изложена в научно-популярной книге [4]. Возможно поэтому они не были достаточно серьезно восприняты специалистами в области моделирования старения, а биологи и медики сосредоточились на поиске экспериментальных доказательств существования предсказанных Дильманом механизмов. В то же время интуитивно понятно, что разрешить противоречие, сформулированное в пунктах 1 и 2 можно не только привлекая дополнительный механизм, описанный в пункте 3. Мы предположили, что длительные тренды роста концентраций гормонов могут быть следствием ухудшения работы желез, вырабатывающих ингибиторы их синтеза, развивающегося в результате потери их (желез) клеточности. Задачей данной работы было создание модели, позволяющей имитировать возрастные изменения гормональных циклов на основе данного предположения.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для количественного анализа in silico была создана мультиагентная имитационная модель, реализованная на платформе Java 2. Биологический смысл данной модели состоит в следующем:

Существует несколько желез, состоящих из постмитотических клеток. Количество вырабатываемого железами гормона зависит от числа клеток. В простейшем случае, когда железы две, гормон, вырабатываемый первой железой активирует вторую железу, а гормон, вырабатываемый второй железой отключает первую железу. Эта минимальная система с отрицательной обратной связью приводит к формированию циклических колебаний концентраций обоих гормонов. Если число клеток, формирующих вторую железу падает ниже определенной величины, то в ответ на гормон первой железы перестает вырабатываться сигнал, останавливающий ее работу. Фактически это и есть потеря чувствительности к гормональным сигналам. Использование системы из трех желез позволяет сделать поведение системы более разнообразным не меняя принципиальных закономерностей.

С кибернетической точки зрения модель представляет собой систему с отрицательной обратной связью, когда выходной сигнал подается на вход и при определенных условиях супрессирует входной сигнал, координируя таким способом состояние системы. В модели рассматривается система трех или двух желёз, связанных обратной связью, с учетом индуцируемого внутренними сигналами апоптоза и стохастического характера ряда протекающих процессов. Устройство модели трех желез изображено на рис. 1

Рис. 1 Схема модели трех желез.

При запуске модели каждая железа формируется как совокупность автономных агентов (клеток). Каждый агент обладает своим набором параметров, индивидуальным для разных желёз.

Железа A вырабатывает за единицу времени (цикл) на каждую свою клетку некоторое количество гормона A, продукция которого подчиняется нормальному закону с заданными параметрами. Каждый цикл часть гормона деградирует. Когда (и если) количество гормона A достигает заданной пороговой величины, запускается железа B. Она работает аналогично железе A. При достижении гормоном B пороговой величины запускается железа C. Она также работает подобно железам A и B. Превышение количества гормона C порогового значения вызывает приостановку работы железы A. Процесс выработки гормонов мы считаем квазистационарным, когда время распространения изменений скорости выработки много меньше характерных времен в системе желез. Клетки желез смертны, и гибнут они в соответствии с закономерностями, изложенными в статье [1]. В качестве исследуемой величины рассматривается зависимость концентрации гормонов в среде от времени (цикла).

Модель двух желёз идеологически повторяет модель трех, отличаясь лишь отсутствием железы B.

Рис. 2 Схема модели двух желез.

Параметры модели являются полностью настраиваемыми (Рис. 3). Программная реализация обладает дружественным интерфейсом и не требует особых пользовательских навыков. Полнофункциональную модель можно скачать на этом сайте в разделе «Материалы для скачивания»

Рис. 3 Панель ввода данных модели.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При изучении модели взаимодействия желез представляется интересным:
• выявление закономерностей распределения концентрации гормонов по времени;
• сравнение распределения концентрации гормонов с учетом потери клеточности и без таковой;
• выявление особенностей поведения имитационной модели.

Сразу оговоримся, что, в силу стохастического задания ряда параметров модели, приведенные ниже рассуждения носят, в значительной степени, качественный характер. Схема потери клеточности, предлагаемая в модели также имеет вероятностный характер. Потому можно говорить о качественных показателях, количественные же их значения будут варьировать от эксперимента к эксперименту.

Более того, как будет показано ниже, изменение некоторых вычисляемых в модели величин демонстрирует поведение, характерное для точек катастроф, когда малое изменение одного из параметров меняет поведение системы как количественно, так и качественно [5].

Более того, как будет показано ниже, изменение некоторых вычисляемых в модели величин демонстрирует поведение, характерное для точек катастроф, когда малое изменение одного из параметров меняет поведение системы как количественно, так и качественно [5].

Исследовалось поведение систем из двух и трех желез. Без учета потери клеточности картина распределения концентрации гормонов по времени достаточно проста (Рис.4). На верхнем графике — распределение количества клеток в каждой железе по времени (в случае нестареющих желез — прямая линия, параллельная оси времени), на нижнем — собственно распределение концентраций, представляющее собой периодические функции со сдвигом фаз.

Рис. 4 Работа ансамбля трех нестареющих желез.

Учет потери клеточности проводился по методике, разработанной ранее [1,2]. Расположение графиков – такое же, как и в случае отсутствия потери клеточности. Как видно на рис. 5 в случае учета потери клеточности картина более сложная, амплитуда кривых распределения концентраций меняется по времени, и, как показывает более подробное рассмотрение, период этих кривых также меняется по времени.

Рис. 5 Работа ансамбля трех желез, теряющих клеточность.

Как показали эксперименты in silico, поведение системы двух желез качественно схоже с поведением системы трех желез (рис. 6), однако эффекты в ней более выражены. В дальнейшем мы будем рассматривать модель системы двух желез.

Рис. 6 Эффекты увеличения уровня гормона, сбоя и остановки цикла в системе двух теряющих клеточность желез.

Как видно на рисунке, в системе двух, объединенных механизмом отрицательной обратной связи, теряющих клеточность желез, может существовать отчетливый тренд увеличения концентрации одного из гормонов (в данном случае гормона А). На этом же графике, приведенном в увеличенном масштабе, можно наблюдать вариации формы пиков кривых зависимости концентрации гормонов от времени, которые имеют место только в системе с потерей клеточности (рис. 7 , нижний график).

Рис. 7 Вариации формы пиков в системе двух теряющих клеточность желез.

С целью выявления закономерностей распределения концентрации гормонов по времени был проведен их частотный анализ (рис. 8). При рассмотрении модели желез с учетом потери клеточности, можно достаточно четко выделить три участка кривой – периодический частотно-модулированный сигнал левее точки А, хаотический (во всяком случае, визуально) между точками А и Б, и монотонно спадающий правее точки Б.

Рис. 8 Динамика частоты колебаний концентрации гормонов. Минорные колебания концентрации после остановки гормонального цикла носят стохастический характер.

При этом надо учитывать, что при расчетах в модели повсюду используются условные и/или нормированные величины, потому к абсолютным значениям каких-либо выходных параметров следует относиться с осторожностью. Однако можно отметить, что, как и в живых системах, при типичной короткой длительности периода в 20-25 циклов (единиц времени, используемых в модели: например, может быть 1 цикл = 1 день) длительность переходного периода от периодической к монотонной фазе зависимости достаточно велика и составляет приблизительно 500 циклов. Эти цифры относятся к индивидуальному набору исходных данных модели (хотя и могут колебаться между экспериментами).

Видно, что на периодическом участке примерно до цикла 2250 частоты колебаний гормонов А и С полностью совпадают, так что их частотные характеристики перекрываются. Далее, на протяжении 500 циклов кривая изменения частоты колебаний концентрации гормона А рассинхронизируется с кривой гормона С (верхний график рисунка), Вслед за этим обе кривые приобретают монотонный спадающий характер. Отметим, что рассинхронизация гормональных циклов с последующим угасанием выработки гормона, одно из типичных проявлений старения.

Для дальнейшего изучения поведения модели была предпринята попытка применения анализа Фурье [6]. Подчеркнем, что анализ Фурье в его классическом виде не вполне подходит для изучения нестационарных процессов, поскольку он обладает способностью отражать лишь частотное отображение сигнала. Однако для выявления общих характеристик данной системы применение анализа Фурье представляется оправданным.

Ниже представлена картина декомпозиции временного представления в частотном пространстве для кривых распределения нормированных значений концентрации гормонов в модели взаимодействия двух желез без учета потери клеточности (А) и с учетом (Б) (рис. 9). В расчетах использовался алгоритм быстрого преобразования Фурье. В силу приведенных выше соображений о нормированности получаемых величин, нас преимущественно интересует форма сигнала, а не его количественные показатели.

Рис. 9 Фурье-анализ динамики изменения концентрации гормонов в системе нестареющих (А) и стареющих (Б) желез.

Из представленных амплитудно-частотных характеристик (АЧХ) можно сделать заключение, что учет потери клеточности привносит в сигнал большое количество дополнительных частотных компонент. В то время как сигнал А состоит из основного низкочастотного сигнала и нескольких минорных высокочастотных сигналов со значительно меньшей амплитудой, сигнал Б содержит значительно большее количество частотных компонент. Можно заключить, что с точки зрения частотных характеристик кривая изменения концентрации гормонов с учетом клеточности состоит из существенно большего количества компонент; с другой стороны, эта сложность возникает не в результате стохастического характера модели. Модель взаимодействия желез без учета клеточности также носит стохастический характер, однако АЧХ для нее имеет небольшое число частотных составляющих. Помимо этого, можно утверждать, что АЧХ концентрации гормона А и гормона С имеют схожий, но не идентичный вид. Другими словами старение системы, образующей гормональные циклы позволяет извлечь дополнительную информацию о контролирующих поведение системы параметрах, в реальных системах управляемых генами. Таким образом, частотный анализ результатов экспериментов in silico дал совершенно неожиданное подтверждение реальности идеологии, положенной В.П. Скулачевым в основу его мысленного эксперимента «с глупыми и умными зайцами» [7].

К сожалению, из классического преобразования Фурье не представляется возможным сделать выводы о временных характеристиках сигнала, которые также могут обладать какими-либо особенностями. Для их изучения необходимо обратиться к частотно-временному представлению сигнала. К этой группе относятся вейвлет-преобразования [8]. Собственно, задача анализа достаточно проста: необходимо взять два набора данных и визуально отобразить их вейвлет-спектрограммы. Если визуальное сравнение выявит какие-либо особенности, проводится их более глубокий анализ.

Для начала проведем вейвлет-анализ результатов работы модели двух желез без учета потери клеточности. Параметры вейвлет-преобразования подбирались с учетом требования выявления различий в наборах данных. В данном случае картины вейвлет-преобразований (рис. 10) для гормона А (вверху) и гормона С (внизу) схожи. Кроме того, отсутствуют какие-либо заметные изменения по времени – вдоль оси Х. По сути дела, после Фурье-анализа это - ожидаемый результат.

Рис. 10 Вейвлет-анализ динамики изменения концентрации гормонов в системе нестареющих желез.

Далее построим вейвлетную плоскость для сигнала с учетом потери клеточности (рис. 11). Часть плоскости для наглядности вырезана и увеличена. Следует отметить, что визуально особенности в поведении кривых концентрации гормонов изменяются синхронно. В целом картина для гормона С повторяет картину для гормона А. При этом картина в первой по времени половине сходна с картиной периодического процесса (хотя мы знаем о его частотной, модуляции, см. рис. 9). Исключение составляет переходный участок, когда картина резко различается.

Рис. 11 Вейвлет-анализ динамики изменения концентрации гормонов в системе стареющих желез.

Для разъяснения вопроса о причинах возникновения таких различий, а также в целом о причинах возникновения нестационарности, была сконструирована модель, из которой исключили стохастические элементы. При неких стандартных исходных значениях стохастическая модель потери клеточности при заданных начальных условиях была аппроксимирована экспонентой.

Приведем выражения для желез А и С:
NA(t) = 5123*e(-0,0006*t)    (1)
NC(t) = 461,3*e(-0,0006*t)    (3)
где t — номер цикла;
NA(t), NC(t) — количество клеток в соответствующей железе в цикле за номером t;

Были проведены численные эксперименты, которые продемонстрировали отсутствие качественных отличий от стохастической модели (рис. 12). Ниже приведен рисунок характеристик аппроксимационной модели. На основании этих расчетов можно сделать вывод об отсутствии значительного влияния стохастических процессов на картину распределения концентраций гормонов в системе желез.

Рис. 12 Эффекты увеличения уровня гормона, сбоя и остановки цикла в системе двух теряющих клеточность желез. Модель без стохастических элементов.

Очевидно, источником изменений является потеря клеточности. При этом относительно медленное падение количества клеток в железах порождает значительное, качественное изменение распределения концентраций гормонов. Построим фазовую картину [9] изменения параметров системы в координатах «Нормированная концентрация А» – «Нормированная концентрация С». На рис. 13 представлена как фазовая картина, так и график зависимости концентрации гормонов от времени. На периодическом участке (левее точки A на нижнем графике) фазовая кривая сходится к точке B (верхний график) по концентрической траектории. Правее точки А фазовая кривая теряет свой регулярный характер.

Рис. 13 Фазовая картина динамики изменения концентрации гормонов в системе нестареющих (А) и стареющих (Б) желез.

Регулярный характер фазовой кривой позволяет по ее началу делать некоторые предположения о дальнейшем развитии. Например, после 4000 циклов концентрация гормона C становится равной 0. Можно легко определить соответствующую этой точке концентрацию гормона А, восстановив прямую С в самом начале формирования фазовой картины. Очевидно, концентрация гормона А соответствует пороговому значению для выключения железы С, однако это индивидуальная величина и ее экспериментальное определение затруднительно.

Если предположение о катастрофическом (в математическим смысле) характере потери регулярности выработки гормонов с потерей клеточности подтвердится, можно будет ставить вопрос о поисках «флагов катастрофы» - событий, предупреждающих о приближении критической точки и понять, верно ли пессимистичное заявление создателя теории катастроф Рене Тома: «Быть может, удастся доказать неизбежность некоторых катастроф, например болезней или смерти» [10]. Впрочем, используя нашу модель можно легко продемонстрировать, что катастрофические сценарии в развитии гормональных циклов связаны с потерей клеточности желез, которая может быть в принципе «отключена» за счет введения ингибиторов генерации апоптозных сигналов типа SkQ либо изменения экспрессии небольшого числе генов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанная нами ранее модель потери клеточности однородной популяции клеток может быть использована для имитации процессов угасания функции железы, клетки которой равномерно вырабатываю гормон в течение жизни. Снижение количества клеток ведет к снижению выработки гормона с соответствующими физиологическими последствиями. Однако принципы работы желез значительно сложнее. Многие железы прямо или опосредованно управляют работой друг друга, формируя гормональные циклы. Интереснейший в плане моделирования старения феномен – потеря чувствительности одних желез к сигналам других. Именно это ведет к сбоям в работе важных для старения гормональных циклов.

Согласно элевационной теории, разработанной В. М. Дильманом, в первую очередь для решения задач практической геронтологии, ключевым моментом старения является потеря чувствительности гипоталамуса к гормональным сигналам, которая ведет к остановке регулируемой гипофизарно-гипоталамической системой гормональных циклов [10]. Справедливость данной теории была подтверждена рядом наблюдений, хотя постановка корректных экспериментов, однозначно подтверждающих верность гипотез, в геронтологии чрезвычайно затруднена. Созданная нами модель, безусловно, не позволяет заменить расчетами биологические опыты. Тем не менее, проведенные с ее помощью эксперименты in silico убеждают, что феномен потери чувствительности к гормональным сигналам с последующей остановкой циклов может быть имитирован в простейшей системе in silico, а в основе данного явления, как и в основе большинства геронтологических феноменов, может лежать потеря клеточности. Как видно на рис. 5 циклический характер выработки гормона А прекращается после примерно 2500 временнoго цикла. Синтез гормона А усиливается. Таким образом железа А теряет чувствительность к ингибирующему действию гормона В, опосредованному железой С, которая теряет к этому моменту клеточность до критического значения. Разработанная модель позволяет имитировать также характерные для стареющих животных нарушения периодичности гормональных циклов (рис. 6,8).

Гормональные изменения играют в управлении онтогенезом животных важнейшую роль. Генетический контроль онтогенеза млекопитающих, по крайней в постнатальной фазе, опосредован в основном изменениями гормональных циклов. Эта идея воплощена в разработанной нами модели. Варьируя небольшое число параметров (см. рис. 3), определяемых в реальных живых системах экспрессией генов контролирующих: уровень апоптозных сигналов, порог ухода клеток в апоптоз, скорость синтеза и распада гормонов, мы можем моделировать такие важные для процесса старения явления, как регулярные изменения амплитуды и частоты колебаний концентрации гормонов, связанные с возрастом сбои гормональных циклов и их прекращение, а также увеличение уровня некоторых гормонов с возрастом, которое связано с деградацией ингибирующей железы. Главный практический смысл нашей работы состоит в иллюстрации того, что вещества замедляющие потерю клеточности, теоретически, могут быть эффективными супрессорами характерных для старения гормональных изменений.

Работа выполнена при финансовой поддержке НИИ Митоинженерии МГУ, Министерства образования и науки РФ, грант ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», госконтракт № 14.740.11.0006 и Министерства здравоохранения и социального развития РФ.

Литература

1. Чистяков В.А. Денисенко Ю.В. Российский Химический Журнал (Журнал Российского Химического Общества им. Д.И. Менделеева). – 2009. - Т. 53, №3. - С. 105-110.
2. Чистяков В.А. Денисенко Ю.В. Успехи геронтологии. – 2010. – Т. 23, №4. – С. 557-563.
3. Scilard L. Proc. nat. Acad. Sci. USA. 1959 Vol. 45. P. 30–45.
4. Дильман. В.М. Большие биологические часы (введение в интегральную медицину) Издательство "Знание" Москва 1982
5. Арнольд В.И. Теория катастроф Москва: Наука, 1990
6. Макарова Н.В. Статистика в Excel / Н.В. Макарова, В.Я. Трофимец. – Москва: Финансы и статистика, 2002
7. Скулачев В.П. Биохимия, 2007, т. 72, № 12, с. 1572—1586
8. Астафьева Н.М. Вейвлет-анализ: основы теории и примеры применения / Астафьева Н.М. // Успехи физических наук. – 1996. Т. 166, №11. - С. 1146-1170
9. Чуличков А.И. Математические модели нелинейной динамики / А.И. Чуличков. – Москва: Физматлит, 2003
10. Арнольд В.И. Теория катастроф / В.И. Арнольд. – Москва: Наука, 1990
11. Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения / - СПб.: Наука, 2003. – 468 с.