Возрастная потеря клеточности: исследование in silico
Введение
Одновременное существование множества противоречащих теорий старения отражает системный кризис современной геронтологии. Одним из подходов, облегчающих построение единой теории старения, может быть формирование некого базового методологического аппарата, основанного на достаточно очевидных посылках, принимаемых большинством биологов. Ввиду сложности этой задачи, определяемой многообразием биохимических, генетических, цитологических и др. явлений сопутствующих старению, можно решать ее по частям, рассматривая последовательно отдельные стороны феномена старения.
Источник:
Чистяков В.А., Денисенко Ю.В. (2009) Возрастная потеря клеточности: исследование in silico, Рос. хим. журн. (Журн. Рос. хим. общества им. Д.И. Менделеева), 53, 105–110.
Выявленные при этом частные закономерности должны быть сведены воедино в результате предполагаемого будущего синтеза. В данной работе предпринята попытка реализации такого подхода применительно к исследованию феномена потери клеточности постмитотических тканей. Уменьшение количества клеток, составляющих ткани и органы, представляется одним из наиболее простых и поэтому надежных механизмов прогрессирующего с возрастом ослабления жизнеспособности многоклеточного организма. Важность этого процесса для старения млекопитающих достаточно хорошо показана [1—4]. Очевидно также, что старение взрослых особей (имаго) двукрылых, к которым относится один из наиболее изученных объектов экспериментальной геронтологии плодовая мушка Drosophila melanogaster, обусловлено преимущественно старением постмитотических тканей [5, 6].
В настоящее время накоплено достаточно фактов, на основе которых можно построить модель возрастной потери клеточности, позволяющую учитывать замедление этого процесса геропротекторами. Ее логические предпосылки следующие:
• Постмитотические клетки способны генерировать вещества, индуцирующие программируемую клеточную смерть (ПКС) [7], например, таким веществом является пероксид водорода. (Далее в качестве индуктора программируемой клеточной смерти будем рассматривать в общем виде некое вещество X, также символом Х обозначать количество этого вещества; нам не хотелось бы конкретизировать природу такого вещества до выяснения механизма потери клеточности.)
• При достижении количества вещества X, выработанного за промежуток времени, который можно назвать циклом, какого-то предела срабатывает механизм самоликвидации биологического клетки.
• Среднее количество вещества X, вырабатываемое в клетках за цикл, составляет величину ниже «порога самоликвидации».
• Поскольку количества Х, вырабатываемые различными клетками взаимно слабозависимы, распределение величины Х будет подчиняться нормальному закону (рапределение Гаусса). Как будет видно из дальнейшего изложения, наличие у функции распределения величины X коэффициентов асимметрии и эксцесса не меняет анализируемых закономерностей принципиально. Главное, чтобы функция распределения X при стремлении аргумента к бесконечности асимптотически приближалась к нулю. Поскольку такая кривая не пересекается с осью абсцисс, теоретически могут существовать сколь угодно большие отклонения от среднего значения Х.
• В клеточной популяции при средней выработке X ниже порога постоянно будут существовать клетки, которые способны генерировать вещество Х в количестве выше «порога самоликвидации».
Примем, что величина Uα (рис. 1) — это пороговое значение X, при превышении которого запускается механизм самоликвидации клетки. Физический смысл Uα – уровень выработки в единицу времени индуктора программируемой клеточной смерти (например, перекиси водорода), превышение которого ведет к запуску ПКС Тогда величина 1 – α (α — площадь темной области на рис. 1) будет равна доле клеток, погибающих в течение цикла (поскольку на рис. 1 приведена нормированная гауссова кривая, то общая площадь под кривой равна единице). Сдвигая величину Uα и/или изменяя стандартное отклонение σ распределения величины Х (для нормированного распределения σ = 1), экспериментаторы (в реальности эволюционирующие живые системы) получают возможность регулировать скорость потери клеточности, а следовательно, и скорость старения. Даже поверхностный визуальный анализ (см. рис. 1) убеждает, что незначительные сдвиги Uα могут вызывать большие изменения 1 – α. Конкретизируя биологический смысл рассматриваемых процессов, можно предположить, что слабые, многократно повторяющиеся воздействия, например постоянное введение малых доз геропротекторов, способны значительно замедлять старение.
Рис. 1. Нормированная кривая нормального распределения.
Методика исследования in silico действия геропротекторов
Для количественного подтверждения изложенной выше концепции была создана многоагентная имитационная модель популяции клеток с использованием подходов, изложенных в работе [8]. Модель реализована на языке Java2. При реализации использованы алгоритмы, взятые из работы [9].
Следует отметить, что задача моделирования популяции клеток в тривиальной постановке, когда агенты (клетки, особи) пассивны и неразличимы, может быть решена аналитически, однако применение многоагентной имитационной модели позволяет поэтапно наращивать сложность постановки задачи, не меняя саму модель концептуально. Более того, такой подход не требует априорных знаний о закономерностях поведения системы. Напротив, исследователь, определяя индивидуальное поведение агента (клетки), может выявить глобальные закономерности поведения системы (организма) как целого, которые формируются как результат взаимодействия агентов со средой и друг с другом. Фактически выявление таких закономерностей и является одной из целей исследования биологического объекта.
Можно предположить, что многоагентная модель, дискретная, децентрализованная, стохастическая и возможно асинхронная, будет точнее отражать поведение биологического объекта, чем непрерывная аналитическая модель [10].
В представленной работе использовалась многоагентная модель, состоящая из 2000 агентов, при этом 1000 агентов вводятся в эксперимент, а 1000 составляют контрольную группу.
Методика эксперимента заключается в следующем. Задается время существования биологической модели в условных циклах. Считается, что каждый агент (клетка) модели вырабатывает некую субстанцию X, причем ее выработка за цикл подчиняется нормальному закону распределения с задаваемым стандартным отклонением. Задается пороговое значение количества Х, превышение которого ведет к гибели агента. Начиная с некоторого цикла, уменьшают математическое ожидание вырабатываемого количества субстанции X на некоторую задаваемую величину. Проводя биологические аналогии, можно сказать, что агенту по графику дают препарат (геропротектор), который уменьшает выработку вещества X.
Существует возможность задания параметров для каждого агента индивидуально, задания местоположения каждого агента, взаимодействия между агентами и т.д., однако для простоты эти возможности в первом приближении не использовались. Результатом численного эксперимента являлось число выживших клеток в зависимости от времени. Модель можно скачать на этом сайте в разделе «Материалы для скачивания».
Результаты эксперимента и их обсуждение
На рис. 2 приведен типичный внешний вид экрана при проведении компьютерного моделирования возрастной потери клеточности с использованием разработанной модели. Средняя величина выработки X в данном случае составляет 100 ед., отклонение — 20 ед., пороговое значение Х — 158 ед., уменьшение среднего значения Х в результате применения геропротектора — 5 ед. На рисунке видно, что хотя пороговое значение превышает среднюю выработку X в 1,58 раза или на ~3σ, примерно две клетки контрольной популяции погибают в каждом цикле.
Препарат начинают вводить с 200-го цикла (рис. 2А). До 200-го цикла (до момента введения протектора) процент гибели клеток в контрольной и экспериментальной группах примерно одинаков. К 200-му циклу в обеих группах выживаемость клеток составила ~ 72% (погибло 28%). С 200-го цикла, когда начал применяться препарат, выживаемость клеток в экспериментальной группе заметно возросла. К 371-му циклу в контрольной группе погибла половина агентов, а в экспериментальной группе к этому моменту погибло ~ 39% клеток. При введении протектора с нулевого цикла (рис. 2Б), разница в выживаемости клеток опытной и контрольной популяциях составила к 367-му циклу 24,5%. Опытная популяция достигает 50%-ного уровня выживаемости только к 800-му циклу. Примечательно, что такая значительная прибавка выживаемости получена при действии протектора, снижающего среднее значение X всего на 5 ед. (5%). Этот сдвиг практически неразличим при исследовании методами вариационной статистики (см. кривые распределения в верхнем правом углу рис. 2). Таким образом, имитационный подход позволяет создавать модели процесса функциональной кумуляции, в которых сверхслабые, статистически неразличимые, многократно повторяющиеся воздействия приводят к значительному физиологическому эффекту.
А
Б
Рис. 2 Вид экрана при проведении компьютерного моделирования с использованием разработанной модели. А – введение протектора с 200 цикла, Б – с нулевого цикла.
Даже в данном несовершенном виде разработанная нами модель вполне пригодна для моделирования физиологических эффектов геропротекторов. Предположим, что анализируемая популяция — это клетки некой железы мыши, а продолжительность цикла равна одному дню. Допустим, что 60%-ная потеря численности клеток ведет к снижению выработки секрета, который инициирует выпадение вибрисс (чувствительных волосков, определяющих у грызунов эффективность ориентировки в пространстве и коммуникации) у мышей. При условиях, отображенных на рис. 2, у контрольных животных потеря вибрисс будет начинаться на 500-ый день жизни, что близко к реальной ситуации. Модельный эксперимент показывает (табл. 1), что даже 2%-ный сдвиг количества Х дает заметную отсрочку начала потери вибрисс, а 5%-ное снижение средней выработки индуктора программируемой клеточной смерти ведет к отдалению начала этого процесса за пределы жизни «виртуальной» мыши — 1000 циклов. Отметим, что эта ситуация напоминает действие 10-(6'-пластохинонил) децилтрифенил фосфония (препарата SkQ1), антиоксиданта нового поколения, разработанного В.П. Скулачевым специально для задач практической геронтологии [11, 12]. Принимающие его мыши не теряют вибрисс на протяжении всего срока жизни.
| Величина сдвига X, % | Отсрочка 60%-ной потери клеточности, циклы |
| 2 | 200 |
| 3 | 240 |
| 4 | 400 |
| 5 | >500 |
Существует множество примеров, убеждающих, что когда увеличение продолжительности жизни особей способствует процветанию вида, живые системы могут достигать замедления старения достаточно быстро (в эволюционном масштабе времени), т.е. естественный отбор на увеличение продолжительности жизни может быть весьма эффективным.
Одним из путей замедления скорости потери клеточности постмитотических тканей, реализуемых в живых организмах, может быть сдвиг порога самоликвидации в сторону его больших значений. Известно, что большей устойчивостью к пероксиду водорода по сравнению с клетками традиционного объекта экспериментальной биологии домовой мыши, обладают клетки таких грызунов-долгожителей, как белоногая мышь и голый землекоп [11, 13].
Введение в организм антиоксидантов сдвигает выработку Х в сторону ее уменьшения. Здесь работает та же самая закономерность, что и в случае снижения чувствительности клеток к пероксиду водорода Поскольку значение «порога программируемой смерти» задано генетически и вряд ли сдвигается при введении антиоксиданта, сравнительно небольшое уменьшение X будет также, как и в предыдущем случае, сопровождаться значительным снижением скорости отмирания клеток, следовательно, и старения. Поэтому действие антиоксиданта, с помощью которого предполагается замедлить старение, должно быть не столько мощным, сколько постоянным, т.е. эффект, вызванный антиоксидантом, должен действовать при длительном его введении. Моделирование показывает, что кратковременное (в течение 1—100 циклов) введение протекторов, полностью подавляющих потерю клеточности, практически не меняет общей динамики этого процесса. По-видимому, именно пролонгированность действия препарата SkQ1, созданного при выполнении российского геронтологического мегапроекта [11], и является его главным преимуществом перед другими антиоксидантами — геропротекторами.
Исследования действия SkQ на дрозофилу в целом подтвердили адекватность предложенной модели. Так, введение препарата в течение недели в середине жизни дрозофилы было неэффективно, в то время как пролонгированное действие препарата на протяжении второй половины жизни продлевало ее срок. Вместе с тем в экспериментах на дрозофиле был обнаружен феномен, который пока не удается смоделировать, а именно, сходство геропротекторных эффектов при кратковременном введении SkQ1 в первую неделю и при постоянном введении препарата [12]. Возможно, этот недостаток модели удастся ликвидировать, снабдив виртуальные клетки неким способным к повреждению генетическим аппаратом.
Тем не менее, использованный нами подход показывает важность оптимизации схемы введения препарата-антиоксиданта для достижения максимальной его эффективности. Как видно из рис. 3, введение одно и того же суммарного количества протектора в разные периоды жизни клеток практически не изменяет финальных результатов их выживаемости в опыте и контроле, т.е. прибавка продолжительности жизни виртуальной популяции клеток практически не зависит от порядка введения препарата. Однако, как следует из рис. 3, от порядка введения препарата существенно зависит площадь под кривой, отражающая общее число «клеткоциклов» за исследуемый период. Этому показателю можно провести ряд биологических параллелей. В частности, если предположить, что моделируется популяция клеток тимуса (вилочковой железы) млекопитающих, которые ответственны за «настройку» иммунной системы, то площадь под кривой будет соответствовать интегральному показателю потенциальной силы иммунного ответа. В общем случае площадь под кривой коррелирует с некой суммарной жизнестойкостью, определяющей качество жизни. Таким образом, величину физиологических эффектов геропротектора пролонгированного действия может определять не только общее количество препарата, но и схема его введения.
Современная биохимия в своих теоретических построениях оперирует в основном средними величинами. Статистические показатели, характеризующие разброс величин (дисперсия, стандартное отклонение) используются, как правило, для оценки статистической значимости различий средних. Между тем другим способом снижения скорости потери клеточности постмитотических тканей может быть уменьшение разброса величины Х, определяемого через стандартное отклонение σ, т.е. повышение точности работы клеточной биоэнергетики.
Как показывают модельные эксперименты, поставленные с введением исходных данных, указанных на рис. 2 Б, незначительные снижение σ приводит к заметному замедлению потери клеточности при неизменной средней выработке вещества Х (табл.2). В связи с этим интересен тот факт, что коэффициент вариации продолжительности жизни мышей, принимавших SkQ1, примерно на 30% ниже контрольного значения (см. табл.1 в работе [12]). Вопрос о том, насколько эти различия могут отражать различия в межклеточных вариациях генерации активных форм кислорода, безусловно актуален и требует отдельного исследования.
| Стандартное отклонение величины Х | Время достижения 50%-ной гибели клеток, циклы |
| 21 | 230 |
| 20 | 380 |
| 19 | 640 |
| 18 | 1000 |
Программа старения многоклеточных организмов частично задается, по-видимому, соотношением X, σ и Uα (порог самоликвидации) в разных тканях, в основном, в тканях желез. Процессы старения разных тканей определяют общую картину саморазрушения организма, которая может варьировать вследствие генетически детерминированных особенностей в старении отдельных желез и тканей. Довольно широко распространены случаи, когда люди сохраняют до глубокой старости цвет и густоту волос, зубы, ясность мышления и т.д. Тем не менее вероятность отказа всей программы старения крайне низка.
Исключительная сложность живых систем чрезвычайно затрудняет воспроизведение in silico реального многообразия свойств моделируемых объектов. Поэтому ценность компьютерных исследований во многом определяется тем, что они могут служить методологической основой для экспериментальной биологии, а именно, давать идеи для новых экспериментов и нетривиальные интерпретации результатов ранее проведенных экспериментов. В связи с этим хотелось бы отметить, что серьезной причиной низкой эффективности геропротекторов может быть их передозировка. Как уже упоминалось выше, хроническое введение антиоксиданта-геропротектора может быть более важным фактором его эффективности, чем «мощность» препарата. Мы полагаем, что в большинстве геронтологических экспериментов используются дозы еще нетоксичные, но уже запускающие клеточные механизмы коррекции антиоксидантного действия в сторону его снижения. На существование таких механизмов многократно обращал внимание исследователей академик В.П. Скулачёв. Удачной попыткой их обойти собственно и стало создание веществ типа SkQ, действующих в наномолярных концентрациях [11, 14].
А
Б
Рис.3. Моделирование введения геропротектора с нулевого по пятисотый (А) и с пятисотого по тысячный (Б) цикл.
Эффективность SkQ определяется его способностью многократно накапливаться в митохондриях. Исходя из вышеизложенной логики даже испытанные в настоящее время наномолярные дозы SkQ, в пересчете на 1 кг массы животных, могут быть избыточными, так же как милли- и микромолярные дозы таких антиоксидантов-геропротекторов, как токоферол, меркаптоэтанол и др. Прогресс «антиоксидантной гериатрии» будет во многом обусловлен созданием высокоэффективных смесей. Очевидно, что минимизация концентраций действующих начал — одна из предпосылок успеха в достижении желаемой эффективности геропротекторов.
В заключение рассмотрим вопрос о соответствии использованных нами параметров распределений реальным распределениям межклеточных вариаций. Как упоминалось выше, современные биохимия и, как ни странно, цитология сосредоточены в основном на анализе средних величин. Тем не менее, есть ряд работ, в которых подробно анализируются межклеточные вариации. Важным элементом биохимии фагоцитоза является уничтожение поглощенных нейтрофилами микроорганизмов за счет усиления внутриклеточной генерации активных форм кислорода (дыхательный взрыв). В статье [15] приведена частотная гистограмма распределения нейтрофилов по уровню генерации супероксидного анион-радикала во время дыхательного взрыва, индуцированного аналогом естественных индукторов этого процесса форбол-12,13-дибутиратом. Данные соответствуют на уровне значимости более 0,6 (по χ²-критерию) логарифмически нормальному распределению с параметрами μ = 2,25 и σ = 0,24 (μ — математическое ожидание, σ — стандартное отклонение).
В работе [16] опубликованы результаты применения методики визуализации расположения отдельных молекул мРНК. На приведенных фотографиях видно, что даже генетически идентичные культуральные клетки значительно варьируют по содержанию мРНК. По мнению авторов, эти различия сглаживаются при синтезе белка. Тем не менее частотная гистограмма распределения клеток по количеству желтого флуоресцирующего протеина соответствует нормальному распределению с параметрами μ = 0,31 и σ = 0,14. Таким образом, использованное в наших экспериментах in silico соотношение между средней величиной и стандартным отклонением соответствует по порядку величин, существующему в природе.
Заключение
Представленные в данной статье материалы, являются отражением достаточно грубого моделирования участия стохастических процессов в управлении старением. Более точное моделирование должно учитывать меж- и внутри-тканевую гетерогенность клеточных популяций, влияние клеток друг на друга. Кроме того, индукторы программируемой клеточной смерти в подпороговых концентрациях могут повреждать ДНК, запуская процессы, в свою очередь способные вызвать смерть клеток. Тем не менее возможности имитационного моделирование далеко не исчерпаны — его аппарат позволит учесть вышеназванные характеристики в более сложных моделях.
Литература
1. Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения.СПб.: Наука, 2003. - 468 с.
2. Анисимов В.Н., Бакеева Л.E., Егормин П.A. и др. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. 5. SKQ1 увеличивает продолжительность жизни и предотвращает развитие признаков старения. Биохимия 2008. Т. 73. № 12. С. 1665 - 1670.
3. Антоненко Ю.Н., Аветисян A.В. , Бакеева Л.E. , Черняк Б.В. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения.1. Катионные производные пластохинона: Синтез и исследование in vitro Биохимия 2008. Т. 73. № 12. С. 1589 - 1606.
4. Джонс М. Т.; Программирование искусственного интеллекта в приложениях. Москва: Издательство ДМК пресс, 2006 г. С. 141-174.
5. Карпов Ю. Г. Имитационное моделирование систем. Введение в моделирование с AnyLogic 5. Издательство: БХВ-Петербург, 2005 г. С. 291-310
6. Кнут, Д. Искусство программирования, т. 2. Москва-Санкт-Петербург-Киев: Издательство Вильямс, 2000 г. С. 146-157
7. Манских В.Н. Пути гибели клетки и их биологическое значение// Цитология 2007. Т. 49. № 11. С.909 - 915.
8. Скулачев В.П. Попытка биохимиков атаковать проблему старения.: "Мегапроект" по проникающим ионам. Первые итоги и перспективы// Биохимия 2007. Т. 72. № 12. С. 1572 - 1586.
9. Csiszar, N. Labinskyy, X. Zhao, F. Hu, S. Serpillon, Z. Huang,P. Ballabh, R. J. Levy,T. H. Hintze, M. S. Wolin, S. N. Austad, A. Podlutsky , Z. Ungvari.Vascular superoxide and hydrogen peroxide production and oxidative stress resistance in two closely related rodent species with disparate longevity// Aging Cell 2007. V.6. № 6. P. 783-797
10. Gruver A.L., Hudson L.L., Sempowski G.D. Immunosenescence of ageing.//J. Pathol. 2007. V.211. №2. P. 144-156.
11. Jung T., Bader N., Grune T. Lipofuscin: formation, distribution, and metabolic consequences.//Ann N Y Acad Sci. 2007. №1119. P.97-111.
12. Krishnan K.J., Reeve A.K., Samuels D.C., Chinnery P.F., Blackwood J.K., Taylor R.W., Wanrooij S., Spelbrink J.N., Lightowlers R.N., Turnbull D.M. What causes mitochondrial DNA deletions in human cells? //Nat Genet. 2008 V.40. №.3. Р.275-279.
13. Miquel J. An update on the oxygen stress-mitochondrial mutation theory of aging: genetic and evolutionary implications // Exp Gerontol. 1998. V.33., №1-2. P. 113-126.
14. Miquel J. Can antioxidant diet supplementation protect against age-related mitochondrial damage?// Ann N Y Acad Sci. 2002 V. 959. P. 508-516.
15. Szucs S., Vámosi G., Póka R., Sárváry A., Bárdos H., Balázs M., Kappelmayer J., Tóth L., Szöllosi J., Adány R. Single-cell measurement of superoxide anion and hydrogen peroxide production by human neutrophils with digital imaging fluorescence microscopy// Cytometry. 1998 Sep 1;33(1):19-31.
16. Raj A., Peskin C.S., Tranchina D., Vargas D.Y., Tyagi S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells // PLoS Biol. 2006 Oct;4(10):e309